|
Proteinbaserte
studier av plantesykdommen potet-tørråte: identifikasjon
og karakterisering av enzymer som bidrar til infeksjonsprosessen
Introduksjon
Mikroorganismer som angriper en plante skiller ut enzymer som muliggjør
invasjon av planten og/ eller som er med på å unnvike
plantens forsvarsmekanismer. Det finnes flere grunner for at disse
enzymer er meget interessante, blant annet følgende:
Identifikasjon av nøkkelenzymer kan gi grunnlag for utvikling
av nye bekjempelsesstrategier (f eks enzymhemmere).
De patogenene mikroorganismens enzymer er ofte svært effektive
i nedbryting av bestemte plantematerialer. Dette betyr at disse
enzymer kan være interessante som biokatalysatorer, dvs at
de muligens kan anvendes til industriell bearbeiding av råstoffer
fra landbruket (f eks i fôrindustrien).
Interaksjoner mellom planter og sykdomsfremkallende mikroorganismer
(heretter kalt "patogener") får mye oppmerksomhet
i disse dager, ikke minst fordi de nye DNA mikromatrise teknikker
gir fantastiske muligheter til å se på gener som blir
skrudd av og på under infeksjonsprosesser. I prinsippet kan
genetiske analyser av infeksjonsprosesser gi innsikt i hva som kan
være nøkkelenzymer for plantepatogene mirkoorganismer.
På tross av nye genetiske teknikker er framgangen i det å
oppnå nærmere forståelse av infeksjonsprosesser
beskjeden.
I dette prosjektet ønsker vi å bruke en mer protein-basert
tilnærming til plante-patogen interaksjoner. Ved å bruke
teknikker innen "proteomics" samt en del kunnskap om enzymer
og enzymologi ønsker vi å se direkte på proteiner
som kan spille en rolle under infeksjonsprosesser. Vi fokuserer
først og fremst på interaksjonen mellom potet og tørråte
soppen Phytophtora infestans. På tross av det faktum at tørråte
er en av de mest ødeleggende og kostbare plantesykdommer
i verden er fortsatt lite kjent om de molekylære mekanismer
bak infeksjonsprosessen. Det har blitt gjort forbausende lite på
studier av de enzymene som produseres og det kan derfor synes på
tide å ta i bruk moderne "proteomics" teknikker
for å komme videre.
Prosjektet er rettet mot identifikasjon og detaljerte studier av
enzymer fra P. infestans, med fokus på enzymer som spiller
spesielle roller under infeksjonsprosessen. Målet er å
skaffe grunnleggende informasjon om utvikling av tørråte
sykdommen og å skaffe nye interessante enzymer med potensial
som biokatalysatorer. Mot slutten av prosjektet kan det bli aktuelt
å bruke en del av de etablerte teknikker og (enzym) screeningsmetoder
til å se på andre interessante plantepatogener. Her
vil målet først og fremst være å framskaffe
nye biokatalysatorer.
Målsetninger:
Hovedmål: Identifikasjon og detaljstudier av enzymer som spiller
en nøkkelrolle under infeksjon av potet med tørråte
patogenet Phytophtora infestans.
Delmål:
· Etablere "proteomics" teknikker (f eks 2D elektroforese).
· Dyrking av P. infestans på medier basert på
potetekstrakter.
· Kartlegging av enzymprofiler under vekst med og uten potetkomponenter
tilstede.
· Detaljstudier av mulige relevante enzymer (kloning av genene;
overuttrykk; avansert enzymologi; testing av mulige hemmere).
· Molekylærbiologisk verifikasjon av enzymenes forekomst
under infeksjonsprosessen (northern blotting).
· Vurdering av enzymenes potensial som biokatalysatorer.
· Anvendelse av etablerte teknikker på andre plante-patogen
interaksjoner.
Miljø (Enzymgruppen
ved IKB)
Prosjektet utføres ved enzymgruppen ved IKB som ledes av
Prof. Vincent Eijsink og som består av rundt 10 personer.
Gruppen fokuserer på protein-orientert biokjemi og på
utnyttelse av enzymer som biokatalysatorer. Det finnes dessuten
kompetanse innen bioinformatikk og proteomics. Eijsink har publisert
rundt 60 artikler i vitenskapelige tidsskrifter med referee. Blant
høydepunktene er tre artikler i det prestisjefylte tidsskriftet
Proceedings of the National Academy of Sciences USA (i 1998, 2000
og 2001), samt en rekke inviterte oversiktsartikler.
Dette prosjektet vil bli knyttet tett opp mot pågående
prosjekter ved IKB og Planteforsk:
· Molecular aspects of pathogenicity of Clavibacter michiganensis
subsp. sepedonicus. (en stipendiat; NFR; 2002-2006; samarbeid mellom
Planteforsk og IKB v Eijsink; prosjektleder Brurberg)
· Molecular genetics of the interaction between Phytopthora
infestans and potato. (en forsker; NFR; 2000 - 2003; prosjektleder
Brurberg)
· Characterization and engineering of enzymes for the conversion
of chitin and related polymers (strategisk program 2001-2005, NFR;
totalt fem mennesker; prosjektleder Eijsink)
Prosjektets plass
i NLHs forskningsstrategi
Prosjektet passer først og fremst innen NLHs satsingsområde
bioteknologi, men har også klare forbindelser med områdene
"mat" og "miljø". Prosjektet er som sådan
sterkt tverrfaglig. En bedre forståelse av sykdomsprosesser
i planter er nødvendig for å kunne utvikle bedre bekjempelsesteknikker
som sikrer bærekraftig utvikling i landbruket og som skåner
miljøet.
Prosjektet knytter bånd mellom det sterke bioteknologiske
(protein-orienterte) miljøet ved NLH og det sterke plantemiljøet
ved Planteforsk. På denne måten styrkes flere av NLHs
kjerneområder (bioteknologi, planter).
Andre strategiske
aspekter
· Plantepatologi bør være et viktig tema ved
NLH. Ås har en "norsk" monopol innen plantepatologi,
som får spesiell omtale i FUGE ("FUnctional GEnomics")
dokumentene.
· Økt forståelse av plantesydomsprosesser og,
forhåpentligvis, utvikling av nye, miljøvennlige bekjempelsesstrategier
er nært tilknyttet politisk korrekte forskningstema som "økologisk
landbruk" og "biokontroll".
· Prosjektet er sterkt protein orientert og vil benytte flere
såkalte "proteomics" teknikker. Prosjektet vil dermed
bidra til å bygge en teknologiplatform for Ås sin satsing
innen FUGE. Det er verd å bemerke seg at det finnes en stor
mangel på forskere som kan mye om proteiner, både i
Norge og ellers i verden.
· Prosjektet vil være tilknyttet flere andre prosjekter
ved NLH og Planteforsk og vil som sådann være del av
en større prosjektcluster.
Global forsknings-
og fremdriftsplan
År 1:
Runde av studier på en tidligere isolert gluthathione transferase
og skriving av artikkel.
Etablering av målemetoder for relevante enzymer (f eks. pectinaser,
cellulaser, cutinaser, amylaser, xylanaser)
Etablering av teknikker innen "proteomics" (1D og 2D elektroforese,
HPLC)
Dyrking av P. infestans på eksisterende medier; utvikling
av medier basert på potetekstrakter.
År 2:
Dyrking av P. infestans på eksisterende medier; utvikling
av medier basert på potetekstrakter.
Kartlegging av enzymprofiler under vekst med og uten potetkomponenter
tilstede.
I denne fasen er hovedmålet å identifisere ekstracellulære
enzymer i P. infestans, med fokus på enzymer som viser endrede
mengder ved endring av vekstmediet. Dvs at vi prøver å
finne enzymer der produksjon blir opp- eller nedregulert etter interaksjon
mellom P. infestans og potet.
År 3:
Identifikasjon av de potensielt mest interessante enzymer (protein
sekvensering etter 2D-elektroforese; masse spektrometri; bioinformatikk
verktøy)
Kloning av genene som koder for potensielt interessante enzymer.
Overuttrykk og detaljstudier av potensielt interessante enzymer
(enzymologi, protein struktur [ekstern samarbeid], hemmere)
År 4:
Molekylærbiologisk verifikasjon av enzymenes forekomst under
infeksjonsprosessen. Dvs at det skal brukes molekylærbiologiske
metoder (blant annet northern blotting) for å sjekke om de
identifiserte enzymer blir uttrykt "differensielt" (dvs
at genuttrykk blir opp- eller nedregulert under infeksjonsprosessen).*
Vurdering av enzymenes potensial som biokatalysatorer.
Anvendelse av etablerte teknikker på andre plant-patogen interaksjoner.*
Skriving av doktorgradsavhandling.
Spørsmålet ved dette prosjektet er hvor mange potensielt
interessante enzymer vi finner. Finner vi mange (f eks > 5) vil
det sannsynligvis bli lite tid igjen til de aktiviteter som er merket
med * i År 4. Finner vi bare noen veldig få er det sannsynlig
at også aktivitetene merket m
|
